酿酒酵母中心代谢网络动力学建模

以酿酒酵母中心代谢网络为研究对象进行代谢网络动力学模拟，将酶反应速率方程改写成普适的形式，模拟了以葡萄糖为碳源的一次生长代谢状态，计算得到了代谢网络达到稳态的代谢流分布以及全部代谢物浓度随时间变化的情况，并将模拟得到的代谢流分布与实验结果进行了比较，结果具有一致性。
[目的]对类黄酮异戊烯转移酶基因在酿酒酵母中的表达进行研究.[方法]以粗毛淫羊藿为材料,对其类黄酮异戊烯转移酶基因(EaPT1)进行克隆,并构建重组质粒,将其转化至酿酒酵母INVSc1中表达,进行黄酮类底物粗酶检测.[结果]获得了大小约1200 bp的EaPT1基因；经SDS-PAGE检测,重组质粒转化后的酵母菌有疑似EaPT1的表达产物；粗酶检测中未能检测到EaPT1酶活性.[结论]为粗毛淫羊藿植物次生代谢,特别是类黄酮生物合成途径的解析奠定基础.
本试验以酿酒酵母和枯草芽孢杆菌作为混合菌种发酵小麦麸皮,通过Amberlite XAD-2柱分离纯化制备麦麸阿魏酰低聚糖(feruloyl oligosaccharides,FOs),探讨麦麸FOs对敌草快(diquat)诱导的大鼠氧化应激是否有缓解作用.试验选用体重相近的断奶雄性大鼠48只,随机分为未攻毒组、攻毒组、攻毒+100 mg/kg BW麦麸FOs组、攻毒+200 mg/kg BW麦麸FOs组、攻毒+300 mg/kg BW麦麸FOs组和攻毒+100 mg/kg BW维生素C组,每组8个重复,每个重复1只鼠,各组大鼠均饲喂相同的商业饲料.麦麸FOs和维生素C配制成水溶液,采用灌胃的方式给予,未攻毒组、攻毒组用生理盐水替代,灌胃体积0.2 mL,连续灌胃15 d.灌胃结束当天,未攻毒组大鼠注射0.3 mL生理盐水,其他5组按0.1 mmol/kg BW的剂量腹腔注射0.3 mL敌草快.敌草快攻毒12 h后取样,分析各组大鼠血浆以及肝脏、肾脏和回肠中总抗氧化能力(T-AOC),过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性以及谷胱甘肽(GSH)和8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)的含量.结果显示:1)通过混菌发酵小麦麸皮制备麦麸FOs,利用Amberlite XAD-2柱进行分离纯化,获得的麦麸FOs浓度为0.059 mmol/g.2)腹腔注射敌草快显著降低大鼠血浆中SOD活性和GSH含量(P<0.05),显著降低大鼠肝脏中T-AOC,CAT、GSH-Px活性及GSH含量(P<0.05),显著降低大鼠肾脏中T-AOC及CAT、SOD活性(P<0.05),显著降低大鼠回肠中T-AOC,CAT、GSH-Px活性及GSH含量(P<0.05),并显著提高大鼠血浆和各组织中8-OHdG含量(P<0.05).3)在敌草快引起的氧化应激状态下,灌胃一定剂量的麦麸FOs可以显著提高大鼠血浆中SOD(400 mg/kg BW)、GSH-Px活性(100和200 mg/kg BW)以及GSH含量(100和200 mg/kg BW)(P<0.05),显著提高大鼠肝脏中T-AOC(100、200和400 mg/kg BW),CAT(200和400 mg/kg BW)、SOD(100、200和400 mg/kg BW)和GSH-Px活性(100、200和400 mg/kg BW)以及GSH含量(100、200和400 mg/kg BW)(P<0.05),显著提高大鼠肾脏中T-AOC(400 mg/kg BW),CAT(200 mg/kg BW)和GSH-Px活性(200和400 mg/kg BW)以及GSH含量(400 mg/kg BW)(P<0.05),显著提高大鼠回肠中T-AOC(200 mg/kg BW),SOD(400 mg/kg BW)和GSH-Px活性(100、200和400 mg/kg BW)以及GSH含量(100、200和400 mg/kg BW)(P<0.05),显著降低血浆和各组织中8-OHdG含量(血浆、肾脏、回肠:100、200和400 mg/kg BW;肝脏:100 mg/kg BW)(P<0.05);且灌胃200、400 mg/kg BW麦麸FOs后,大鼠血浆和组织中部分抗氧化相关指标可恢复到正常生理状态水平.综上所述,本试验制备的麦麸FOs可以通过有效提高大鼠血浆和组织中抗氧酶活性和GSH含量,降低DNA氧化应激代谢产物8-OHdG的含量,有效缓解由敌草快诱导产生的氧化应激.
将PCR合成的瑞氏木霉(Trichoderma reesei)β-内切葡聚糖酶I(EGI)cDNA基因片断分别插入酵母met10和pgk1启动子和终止子序列之间,构建了在不同启动子控制下,具有不同拷贝数的eg1表达分泌质粒pRS415ME、pRS415PE和pRS425PE.通过电转化使重组质粒转移至实验室酿酒酵母H158菌株中,分别得到了3株酵母转化子H1p、H2p和H1m.在3株酵母转化子中,重组β-内切葡聚糖酶I都能在酶自身信号肽序列引导下进行分泌型表达.在YPD培养基中3株重组酵母生长速率大致相同,H1m,H1p与H2p的内切葡聚糖酶活力分别为70.4,126.7和125.0 U/mL.
对酿酒葡萄品种赤霞珠果皮色素提取工艺进行研究,得到色素提取的最佳工艺:葡萄果皮在滤纸上吸干10 min,以100 mL盐酸-乙醇(15:85)混合液为提取剂,浸提时间为30 min,能最大限度的浸提葡萄皮中的色素,充分表现葡萄的着色情况.
根据NCBI中的木糖还原酶基因序列设计引物,利用高保真聚合酶克隆树干毕赤酵母木糖还原酶基因,加A后克隆到质粒pGM-T中,测序验证.然后将目的基因克隆到舍有强启动子的穿梭表达载体p424GPD中,构建含有XYL1基因的重组质粒p424GPD-XYL1.将p424GPD-XYL1转化到大肠杆菌中,提取总蛋白,聚丙烯酰胺凝胶电泳分析.酶活测定确定木糖还原酶基因XYL1在大肠杆菌中得到活性表达,表明表达载体构建成功.表达载体的成功构建为后续构建重组酿酒酵母利用木糖发酵奠定基础.